Iniciando uma revolução de biossensores fluorescentes

Um grande avanço são os “biossensores fluorescentes ativados por ligação” de alto contraste (nanosensores) que só acendem quando se ligam à molécula alvo, mas criar tais nanossensores é desafiador, pois a ligação efetiva ao alvo e um interruptor de fluorescência precisam ser combinados em um pequeno pacote molecular que também possa ser entregue com eficiência a vários tipos de amostras e fabricado em escala de forma econômica.

Agora, uma equipe de pesquisa colaborativa do Wyss Institute da Universidade de Harvard, da Harvard Medical School (HMS), do MIT e da Universidade de Edimburgo, no Reino Unido, desenvolveu uma plataforma de biologia sintética para agilizar a descoberta, a evolução molecular e a fabricação econômica de nanosensores pequenos e altamente eficientes que podem detectar proteínas, peptídeos e pequenas moléculas específicas aumentando sua fluorescência em até 100 vezes em menos de um segundo. Como um componente-chave, a plataforma usa novos aminoácidos fluorogênicos (FgAAs) que podem ser codificados em pequenas sequências de proteínas de ligação ao alvo (ligantes) com a ajuda de uma metodologia inovadora que permite a em vitro expansão do código genético. Por meio de um processo de triagem de sensores de alto rendimento, validação e evolução direcionada, a plataforma permite a transformação rápida e econômica de ligantes de proteínas em nanosensores de alto contraste para uma ampla gama de aplicações em pesquisa fundamental, monitoramento ambiental, diagnósticos médicos e terapêutica aumentada. As descobertas são publicadas em Comunicações da Natureza.

“Há muito tempo trabalhamos na expansão do código genético das células para dotá-las de novas capacidades que permitam a pesquisa, a biotecnologia e a medicina em diferentes áreas, e este estudo é uma extensão altamente promissora desse esforço. em vitro“, disse o membro do corpo docente do Wyss Core, George Church, Ph.D., que liderou o estudo. “Esta nova plataforma de biologia sintética resolve muitos dos obstáculos que estavam no caminho da atualização de proteínas com novas químicas, como exemplificado por biossensores instantâneos mais capazes, e está pronta para impactar muitas áreas biomédicas.” Church é um líder da Plataforma de Biologia Sintética do Wyss Institute, e também o Professor Robert Winthrop de Genética na HMS e Professor de Ciências da Saúde e Tecnologia na Universidade de Harvard e no MIT.

Proteína mais andaime é igual a nanosensor

A equipe, liderada pelo coautor e coautor correspondente Erkin Kuru, Ph.D. no grupo de Church, baseou-se na descoberta anterior de que os FgAAs poderiam converter ligantes de proteínas conhecidos em sensores ópticos cuja fluorescência é ativada quando seu FgAA é imprensado entre sua sequência de ligantes e a molécula alvo. Os pesquisadores do Wyss colaboraram com o coautor correspondente Marc Vendrell, Ph.D., um professor da Universidade de Edimburgo e especialista em química translacional e imagem biomédica no estudo com quem Kuru compartilhou um interesse inicial em FgAAs.

Começando na pandemia, a equipe primeiro imaginou um “diagnóstico instantâneo de COVID-19” e se concentrou em um anticorpo projetado em miniatura (nanocorpo) que se liga à proteína Spike do SARS-CoV-2 na superfície do vírus. Eles criaram centenas de variantes do ligante nas quais essencialmente montaram FgAAs ligando quimicamente aminoácidos de cisteína ou lisina que foram geneticamente introduzidos em posições conhecidas por estarem em contato próximo com o alvo Spike a um dos 20 diferentes andaimes químicos fluorogênicos. Usando um ensaio de ligação simples, eles selecionaram as variantes fluorogênicas que produziram os maiores aumentos na fluorescência em milissegundos após a ligação ao alvo.

Eles então usaram o mesmo processo para projetar nanosensores a partir de nanocorpos ou miniproteínas que se ligam a diferentes locais-alvo do SARS-CoV-2, bem como a uma variedade de outros alvos moleculares, incluindo o receptor do fator de crescimento celular EGFR relevante para o câncer, o peptídeo ALFA-tag usado por biólogos celulares para rastrear proteínas dentro das células e o hormônio do estresse cortisol. Mais importante, os nanosensores também sinalizaram efetivamente a presença de seus alvos em células humanas e bactérias vivas sob o microscópio, demonstrando sua utilidade como ferramentas de imagem eficazes.

Evolução do nanoensor

Apesar do seu potencial, a primeira versão da plataforma era limitada por depender de um processo trabalhoso e demorado envolvendo múltiplas etapas de purificação das sequências de ligantes produzidas. “Queríamos expandir nosso espaço de design molecular muito mais aumentando as capacidades de alto rendimento da plataforma”, disse Kuru. “Para conseguir isso, habilitamos o ribossomo, que sintetiza naturalmente todas as proteínas nas células, para fazer a maior parte do trabalho em um processo livre de células projetado.”

Na versão 2.0 de sua plataforma, a equipe pré-fabricou um chamado “aminoácido sintético” com um arcabouço fluorogênico já pré-anexado a ele. Aminoácidos sintéticos já provaram seu valor em terapêuticas como o medicamento para perda de peso Ozempic; no entanto, eles não podem ser facilmente incorporados em sequências de proteínas porque não há maquinário natural para que sejam manipulados pelo ribossomo. “Para superar esse obstáculo, reatribuímos um códon raramente usado no código genético universal com a ajuda de uma nova química de expansão genética, para que ele pudesse codificar aminoácidos sintéticos como nossos FgAAs não padronizados pré-fabricados. Essencialmente, nós adaptamos o processo de síntese de proteínas para a construção de nanosensores fluorescentes ativados por ligação”, disse o co-primeiro autor Jonathan Rittichier, Ph.D., que codesenvolveu o método.

Seu novo processo não só permitiu que os pesquisadores produzissem milhões de candidatos a nanossensores de uma vez, mas também ajudou a acelerar os testes subsequentes dos nanossensores, já que toda a mistura de síntese poderia ser combinada diretamente com a molécula alvo ou adicionada a células vivas sem nenhuma purificação adicional. Eles agora podiam investigar centenas de variantes em um dia, em vez de algumas dezenas ao longo de várias semanas. Destacando o poder da plataforma avançada, eles descobriram uma posição específica para codificar seus FgAAs no ligante nanocorpo SARS-CoV-2 original que, inesperadamente, resultou em um nanossensor de maior afinidade do que seu nanossensor COVID-19 original ao entrar em contato com a proteína alvo Spike.

Finalmente, como isso aumentaria significativamente o potencial para criar nanossensores superiores, a equipe alavancou sua plataforma para otimizar a sequência de nanocorpos em si. Eles aproveitaram um processo clássico de biologia sintética conhecido como “evolução direcionada”, no qual as proteínas são otimizadas por meio de ciclos iterativos de design-construção-teste que usam versões de uma proteína com capacidades máximas identificadas em um ciclo como base para encontrar outras ainda melhores no ciclo seguinte. Começando com o melhor nanossensor que eles haviam projetado anteriormente para detectar instantaneamente a proteína Spike da cepa original do SARS-CoV-2, Kuru, Rittichier e a equipe criaram bibliotecas expansivas de nanocorpos abrangendo variantes que mantinham o FgAA não padrão na posição original, mas tinham muitos aminoácidos padrão em outras posições críticas substituídos por outros estruturalmente diferentes. A evolução do melhor deles os levou a novos nanossensores com ordens de magnitude de afinidades de ligação maiores em relação à proteína Spike. Curiosamente, ao usar uma versão ajustada desse sistema de evolução direcionada, eles descobriram nanossensores que eram capazes de detectar seletivamente variantes distintas e mais novas do Omicron.

“Este é um importante passo à frente em nossas capacidades de projetar rapidamente biossensores fluorescentes de baixo custo para monitoramento de doenças em tempo real e com enorme potencial para diagnósticos e medicina de precisão”, disse Vendrell. Kuru acrescentou: “também podemos incorporar aminoácidos sintéticos com muitas outras funcionalidades em todos os tipos de proteínas para criar novas terapêuticas e uma gama muito mais ampla de ferramentas de pesquisa”. De fato, Kuru e as coautoras Helena de Puig, Ph.D. e Allison Flores, juntamente com Church e o autor sênior e membro do Wyss Core Faculty James Collins, Ph.D., também embarcaram no projeto AminoX do Wyss Institute, que alavanca a plataforma para desenvolver novas terapias.

“Este trabalho altamente inovador que permite uma nova e mais poderosa geração de biossensores ativados por ligação demonstra os notáveis ​​poderes da biologia sintética. A equipe da Wyss teve sucesso em projetar um processo biológico fundamental em uma plataforma com vasto potencial para, em última análise, resolver muitos problemas diagnósticos e terapêuticos”, disse o diretor fundador da Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., que também é o Judah Folkman Professor de Biologia Vascular no HMS e no Hospital Infantil de Boston, e o Hansjörg Wyss Professor de Engenharia de Inspiração Biológica no SEAS.

Autores adicionais do estudo são Subhrajit Rout, Isaac Han, Abigail Reese, Thomas Bartlett, Fabio De Moliner, Sylvie Bernier, Jason Galpin, Jorge Marchand, William Bedell, Lindsay Robinson-McCarthy, Christopher Ahern, Thomas Bernhardt e David Rudner. O estudo foi apoiado por um Wyss Institute Validation Project, US Department of Energy Grant (prêmio nº DE-FG02-02ER63445) e ERC Consolidator Grant (prêmio nº DYNAFLUORS, 771443), bem como uma Life Science Research Foundation Fellowship para Kuru.